Отбор эталонных генов для нормализации RT-qPCR у Musca domestica L. (Diptera: Muscidae)

Ксения Сергеевна Крестоношина, Анастасия Дмитриевна Мельничук, Ksenia Krestonoshina, Anastasia Melnichuk

Аннотация


Насекомые-вредители являются одной из основных угроз для сельскохозяйственной деятельности. Исторически, для борьбы с ними принято использовать химические средства защиты (инсектициды). Однако в их применении находят множество недостатков, основным из которых является токсикологическое воздействие на нецелевые объекты, снижение биоразнообразия и развитие резистентности у насекомых вредителей. Для комплексной борьбы с ними необходимо знать особенности популяций: их фенотипический и генотипический состав.  Сегодня молекулярно-генетические исследования всё чаще используются в оценке стабильности популяций, особенно методы RT-qPCR. Однако данный метод требует внимательного подбора референсных генов. В большинстве исследований обозначают гены, экспрессия которых изменилась в ответ на некоторое воздействие, но практически не раскрывают в отношении каких генов производилась нормализация генов-мишеней и проводилась ли предварительная оценка стабильности эталонных генов. Наше исследование проводилось на Musca domestica. Обладая коротким жизненным циклом и высоким репродуктивным потенциалом, комнатная муха часто служит модельным организмом для изучения популяционных процессов и изучения механизмов инсектицидной устойчивости у насекомых.  В настоящее время в научных базах данных мало информации о подборе референсных генов для исследования экспрессии генов данного объекта. В данной работе было протестировано четыре гена кандидата для оценки уровня транскриптов на трех линиях модельного организма Musca domestica. Анализ наиболее стабильных эталонных генов для 55 образцов проводился в программе RefFinder, которая использует несколько алгоритмов оценки референсных генов: Delta Ct, BestKeeper, NormFinder и Genorm. По результатам исследования наиболее надежными признан ген EF-1.


Ключевые слова


популяция; экспрессия генов; референсные гены; Musca domestica, инсектициды; резистентность

Полный текст:

PDF

Литература


Ананьева Е. Е., Мацкало Л. Л., Буторина А. А. Оценка токсического действия системных инсектицидов на мышевидных грызунов на примере степной пеструшки (lagurus lagurus) // Проблемы биологии, зоотехнии и биотехнологии: Сборник трудов научно-практической конф. (Новосибирск, 14–18 декаб. 2020 г.). Новосибирск, 2021.

С. 60-65.

Горбатов В. С., Астайкина А. А., Аптикаев Р.С, Тихонов В.В. Сравнительная оценка опасности и риска пестицидов для водных организмов //Агрохимия. 2019. № 11. С. 17-26. doi: 10.1134/S0002188119110061

Джумаева М. К. Воздействие сельскохозяйственных пестицидов на окружающую среду // Central Asian Journal of Medical and Natural Science. 2023. Т. 4. № 1. С. 381-385.

Замотайлов А.С., Попов И.Б., Белый А.И. Экология насекомых. Краткий курс лекций. Краснодар: КубГАУ, 2009. 184 с.

Никоноров Ю. М., Беньковская Г. В. Селекция на продолжительность жизни в лабораторных линиях комнатной мухи Musca domestica // Биомика. 2013. Т. 5. № 1-2. С. 44-47.

Оберемок В. В., Зайцев А. С., Левченко Н. Н., Ниадар П. М. Краткий обзор наиболее популярных современных инсектицидов и перспективы создания ДНК-инсектицидов // Энтомологическое обозрение. 2015. Т. 94. № 3. С. 507-518.

Andersen C. L., Jensen J. L., Ørntoft T. F. Normalization of real-time quantitative reverse transcription-PCR data: a model-based variance estimation approach to identify genes suited for normalization, applied to bladder and colon cancer data sets // Cancer research. 2004. Vol. 64. no. 15. С. 5245-5250. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-04-0496

Boaventura D., Martin M., Pozzebon A., Mota-Sanchez D., Nauen R. Monitoring of target-site mutations conferring insecticide resistance in Spodoptera frugiperda // Insects. 2020. Vol. 11. no. 8. P. 545. doi: 10.3390/insects11080545.

Deindl E., Boengler K., van Royen N., Schaper W. Differential expression of GAPDH and beta3-actin in growing collateral arteries // Molecular and cellular biochemistry. 2002. Vol. 236. P. 139-146. doi: 10.1023/a:1016166127465. PMID: 12190113.

Hasssan A. O., Obeagu E. I., Oluwasinmile B. O. Evaluation of different microbial pathogens associated with the external surfaces of houseflies and to determine the antibiotic susceptibility pattern of recovered bacterial pathogens in Owo // International Journal of Current Research in Medical Sciences. 2022. Vol. 8. no. 1. P. 1-13. doi:http://dx.doi.org/10.22192/ijcrms.2022.08.01.001

Hussam S. A. Role of house flies (Musca domestica) as vector host for parasitic pathogens in Al-Diwaniya Province / Iraq // International Journal of Science and Research, 2015. P. 1961-1965.

Menozzi P., Shi M. A., Lougarre A., Tang Z. H., Fournier D. Mutations of acetylcholinesterase which confer insecticide resistance in Drosophila melanogaster populations // BMC evolutionary biology. 2004. Vol. 4. P. 1-7. doi: 10.1186/1471-2148-4-4.

Monyama M. C., Onyiche E. T., Taioe M. O., Nkhebenyane J. S., Thekisoe O. M. Bacterial pathogens identified from houseflies in different human and animal settings: A systematic review and meta-analysis // Veterinary Medicine and Science. 2022. Vol. 8. no. 2. P. 827-844. doi: 10.1002/vms3.496.

Nayduch D., Neupane S., Pickens V., Purvis T., Olds C. House flies are underappreciated yet important reservoirs and vectors of microbial threats to animal and human health // Microorganisms. 2023. Vol. 11. no. 3. P. 583. doi: 10.3390/microorganisms11030583.

Olagunju E. A. Housefly: Common zoonotic diseases transmitted and control // Journal of Zoonotic Diseases. 2022. Vol. 6. no. 1. P. 1-10. doi: 10.22034/jzd.2022.14378

Otu-Bassey I. B., Efretuei G. K., Mbah M. Gut Parasites of medical importance harboured by Musca domestica in Calabar, Nigeria // Tropical Parasitology. 2022. Vol. 12. no. 2. P. 99. doi: 10.4103/tp.tp_51_21.

Pfaffl M.W., Tichopad A., Prgomet C., Neuvians T. P. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper--Excel-based tool using pair-wise correlations // Biotechnology letters. 2004. Vol. 26. P. 509-515. doi: 10.1023/b:bile.0000019559.84305.47

Radonić A., Thulke S., Mackay I. M., Landt O., Siegert W., Nitsche A. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR // Biochemical and biophysical research communications. 2004. Vol. 313. no. 4. P. 856-862. doi: 10.1016/j.bbrc.2003.11.177.

Riveron J. M., Yunta C., Ibrahim S. S., Djouaka R., Irving H., Menze B. D.,

Ismail H. M., Hemingway J., Ranson H., Albert A., Wondji C. S. A single mutation in the GSTe2 gene allows tracking of metabolically based insecticide resistance in a major malaria vector // Genome biology. 2014. Vol. 15. no. 2. P. 1-20. doi: 10.1186/gb-2014-15-2-r27.

Segal E., Shapira M., Regev A., Pe'er D., Botstein D., Koller D., Friedman N. Module networks: identifying regulatory modules and their condition-specific regulators from gene expression data // Nature genetics. 2003. Vol. 34. no. 2. P. 166-176. doi: 10.1038/ng1165. PMID: 12740579.

Silver N., Best S., Jiang J., Thein S. L. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR / /BMC molecular biology. 2006. Vol. 7. no. 1. P. 1-9.

Suzuki T., Higgins P. J., Crawford D. R. Control selection for RNA quantitation // Biotechniques. 2000. Vol. 29. no. 2. P. 332-337. doi: 10.2144/00292rv02

Thellin O., Zorzi W., Lakaye B., De Borman B., Coumans B., Hennen G., Grisar T., Igout A., Heinen E. Housekeeping genes as internal standards: use and limits // J. Biotechnol. 1999. Vol. 75. P. 291-295. doi: 10.1016/s0168-1656(99)00163-7. PMID: 10617337

Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes // Genome biology. 2002. Vol. 3. no. 7. P. 1-12. doi: 10.1186/gb-2002-3-7-research0034

Zhong H., Simons J. W. Direct comparison of GAPDH, β-actin, cyclophilin, and 28S rRNA as internal standards for quantifying RNA levels under hypoxia // Biochemical and biophysical research communications. 1999. Vol. 259. no. 3. P. 523-526. doi: 10.1006/bbrc.1999.0815

Zhong M., Wang X., Wen J., Cai J., Wu C., Aly S. M. Selection of reference genes for quantitative gene expression studies in the house fly (Musca domestica L.) using reverse transcription quantitative real-time PCR // Acta Biochim Biophys Sin. 2013. Vol. 45. no. 12. P. 1069-1073. doi: 10.1093/abbs/gmt111

Zhou C. F., Lin P., Yao X. H., Wang K. L., Chang J., Han X. J. Selection of reference genes for quantitative real-time pcr in six oil-tea Camellia based on rna-seq // Molecular biology. 2013. Vol. 47. no. 6. P. 836-851. dio: 10.1134/S0026893313060198




DOI: http://dx.doi.org/10.17076/eb1870

Ссылки

  • На текущий момент ссылки отсутствуют.


© Труды КарНЦ РАН, 2014-2019